W roku 1939 w szpitalu było 600 łóżek, a dyrektorem był dr Roman Ignacy Szpikowski. W pierwszych dniach oblężenia Warszawy zburzony został budynek Izby Przyjęć, w gruzach którego zginął lekarz dyżurny dr Janina Dalikowska i pielęgniarka siostra zakonna Wójcik. Dyrektor Szpitala dr Szpikowski i asystent dr Józefa Pakulska zasypani zostali gruzem. Po ustaniu działań wojennych cały personel zespolił się we wszystkich odmianach walki podziemnej z okupantem, a do szczególnych zadań należały: kontakty z ruchem oporu Getta, ratowanie skazanych na śmierć więźniów Pawiaka i ochrona wywożonej ludności cywilnej. Wykorzystywano charakter szpitala, jego położenie w sąsiedztwie cmentarzy, ogrodów warzywnych. Do grupy organizatorów ruchu: doktora Szpikowskiego - dyrektora szpitala i pracowników Henryka Iwańskiego, Pawła Kowalskiego, Stanisława Sokolnickiego, Jana Skoczka, Zdzisława Nosarzewskiego, Mariana Kowalskiego dołączyli się wszyscy lekarze, kapelan szpitala ks. Władysław Smyrski, pielęgniarki z przełożoną pielęgniarek Heleną Berne na czele oraz pracownicy fizyczni: Pludowski, Piekarzewski, Iwański, Senderski, Kruszewski, Kania, Motyliński, Dyjakowski, Paradowski, Jurczyński, Jagodziński, Mikołajko, Delążek, Piskorowski, Bawarski, Ogrodowski, Mikulski, Wysocka, Bujakowska, Lichota, Filipiński, Gregorkiewicz, Zacharski, Lewandowski. Komendantem grupy został kpt. Henryk Iwański, a zastępcami Paweł Kowalski i Jan Skoczek. Grupa Szpitala Zakaźnego wystawiała różnego typu fałszywe zaświadczenia, przechowywała na terenie osoby zagrożone i Żydów, skupowała, magazynowała i rozprowadzała amunicję i broń, produkowała granaty ,,filipinki", prowadziła nasłuch radiowy i kolportowała gazetki, prowadziła szkolenie bojowe i przerzucała zagrożonych na wschód. Do najważniejszych akcji należy zaliczyć:

• Wykopanie ukrytej przez Wojsko Polskie na terenie Szpitala Św. Łazarza broni i przewiezienie jej w wózkach do śmieci na teren Szpitala Zakaźnego
• Przewóz broni ze Szpitala Zakaźnego( w dywanie) do mieszkania dyrektora dra Szpikowskiego
• Przewóz broni w butlach tlenowych na dworzec kolejki grójeckiej
• Przewóz broni do Getta we współdziałaniu z grupą Żydów pod dowództwem dra Celmajster - Niemirskiego
• Przeniesienie i ukrycie broni i materiałów wybuchowych po aresztowaniu Jana Skoczka, członka grupy szpitalnej
• Nawiązanie kontaktu z przedstawicielami szpitala żydowskiego, dyrektorem Goldfarbem, doktorem Celmajstrem-Niemirskim i doktorem Tomersonem, po naradzie odbytej w mieszkaniu dyrektora Szpikowskiego
• Dostarczanie do Getta przed i w czasie powstania żywności, leków, broni, amunicji, przerzucanie Żydów oraz dwóch radzieckich skoczków spadochronowych Kostaniewa i Fedora z Getta przez kościół na Lesznie przy współudziale proboszcza ks. Godlewskiego
• Wyprowadzenie z Getta, po upadku powstania, trzydziestoosobowej grupy bojowej z pełnym uzbrojeniem i ukrycie jej na terenie szpitala, a następnie na wschód
• Wykonywanie i wydawanie fałszywych zaświadczeń i dokumentów pracy
• Zbieranie i przekazywanie na Pawiak zakażonego materiału dla więźniów, aby umożliwić im dostanie się na leczenie do Szpitala Zakaźnego
• Wydanie władzom niemieckim pewnych zwłok zamiast więźniarki Weinclowej skazanej na śmierć, a przysłanej z Pawiaka, dzięki wszczepieniu jej choroby zakaźnej
• Umożliwienie ucieczki spod ,,opieki" granatowej policji 4 więźniów z Pawiaka przebywających na obserwacji w szpitalu
• Udział w Powstaniu Warszawskim w Zgrupowaniu Chrobry. 

W czasie okupacji zginął w egzekucji ulicznej laborant Józef Ogrodowski, a jeden z najbardziej czynnych z grupy szpitalnej gospodarz Jan Skoczek, aresztowany w Grójcu, został rozstrzelany przez Gestapo.

Dr Tadeusz Mockałło, włączony w akcję przekazywania zakażonego materiału na Pawiak i przejmowania zakażonych więźniów, aresztowany, a później zwolniony, po ponownym wezwaniu na Gestapo, schronił się na terenach wschodnich.

Powstanie Warszawskie zaskoczyło dyrektora Szpikowskiego w domu przy ul. Białej, skąd usiłował przedostać się do Szpitala Zakaźnego. W drodze zatrzymał się w Szpitalu Jana Bożego, skąd wyszedł po przerwaniu artyleryjskiego ognia, który zburzył zupełnie ten szpital. Mając zamkniętą drogę na Wolę, objął punkt opatrunkowy batalionów ,,Parasol" i ,,Zośka", mieszczący się przy ul. Długiej 23, gdzie zginął w pierwszych dniach września od niemieckiego pocisku armatniego.

Wybuch powstania warszawskiego mobilizuje natychmiast Szpital Zakaźny do usług służby sanitarnej na odcinku Wola. Kierownik gospodarczy Włodzimierz Włodarski wytycza punkty sanitarne i zawiadamia lekarzy. Zgłaszają się natychmiast: dr Józefa Pakulska, dr Stanisława Kulesza, dr Mieczysław Rogalski, późnym wieczorem Paweł Kubica, a w nocy dr Jan Barcz.

W dniu 3 sierpnia giną od strzałów z bliska: kierownik apteki mgr Dziedziak i sześciu mężczyzn usiłujących schronić się na terenie szpitala.

Dnia 5 sierpnia szpital przeżywa grozę masowej egzekucji. Po spaleniu sąsiadującej ze szpitalem fabryki Franaszka i wymordowaniu załogi i rodziny właściciela, bandy żołnierzy dobijały się do bramy szpitala. Portier Władysław Przesmycki po otwarciu bramy ginie od strzału z bliska, a zaraz po nim giną pracownicy szpitala: Stefan Mikulski, Kazimierz Tyczyński, Aleksander Delążek i Władysław Kwiatkowski. Wypędzony i zgrupowany przy wyjściowej bramie personel szpitala, chorzy i uciekinierzy okolicznych domów oczekują zapowiedzianej egzekucji. Po pierwszych salwach odważna i energiczna interwencja doktora Pawła Kubicy przerywa akcję i doprowadza do pertraktacji, w wyniku której lekarz niemiecki Hartlib, szef odcinka służby zdrowia, przerywa egzekucję. W dniu tym straciło życie10 osób spoza terenu szpitala oraz dr Jan Barcz i pracownik terenowy Marek Iliński, a ksiądz Niczyporowicz został ciężko ranny. Dr Kubica, którego postawa uratowała pozostałych od śmierci, wysunął się na stanowisko reprezentanta Szpitala, osłaniając wielokrotnie personel, chorych i ukrywających się przed atakami Niemców i chroniąc mienie szpitalne przed grabieżą. Wieczorem tego pamiętnego dnia doprowadzeni do szpitala zakaźnego dr med. Manteuffel, dr med. Wesołowski i lek med. Wardzianka dla wzmocnienia obsady niemieckiego punktu operacyjnego, utworzonego na terenie Szpitala Zakaźnego. Przynieśli oni wiadomość o potwornym wymordowaniu wszystkich lekarzy w Szpitalu Wolskim.

Dnia 6 sierpnia utworzony został punkt operacyjno-opatrunkowy grupy gen. Reinefarta, a na terenie Szpitala zamieszkał dr Hartlib i generał Dirlewanger, pod którego terrorem pozostawał szpital aż do chwili ewakuacji.

W ciągu następnych dni lekarze Szpitala nieśli pomoc rannym przebywającym w piwnicach wypalonych domów i zaopatrywali w leki i żywność ludność ewakuowaną z Warszawy. Specjalnie niebezpieczne było zaopatrywanie nocą w żywność pracowników fabryki Franaszka, ocalonych z masowej egzekucji i ukrywających się w kanałach fabryki. Pracownicy ci zostali następnie przeprowadzeni do Szpitala i umieszczeni w salach chorych.

Dnia 13 sierpnia oddział gestapo zarządził apel wszystkich lekarzy w celu wywiezienia ich do obozu w Pruszkowie. Kolejna interwencja doktora Kubicy u Hartliba uwalnia lekarzy i inny personel Szpitala umożliwiając im dalszą opiekę nad chorymi i ukrywającymi się. W interwencjach tych dzielnie sekunduje Kubicy studentka medycyny Joanna Kryńska, której odwaga osobista i dobra znajomość języka niemieckiego w wielu wypadkach ułatwiła kontakt z władzami niemieckimi i zrozumienie potrzeb szpitala. Nie udało się jednak zapobiec kolejnej łapance personelu fizycznego i osób ukrywających się, których partiami wywożono do Pruszkowa i Suchedniowa.

W dniu wybuchu Powstania Szpital - po wymarszu grup bojowych - stał się miejscem schronienia około 600 mieszkańców, których część personel szpitala przetransportował poza obręb Warszawy w licznych wyprawach po żywność i zaopatrzenie w leki. Szpital zorganizował również punkty pomocy dla ewakuowanej ludności, wydając gorącą kawę i żywność. Punkty te, po kilku dniach działalności zostały przez Niemców zlikwidowane po uprzednim sfotografowaniu.

Dnia 9 sierpnia Niemcy przyprowadzili na teren Szpitala dwóch młodocianych powstańców i po zniszczeniu na nich ubrań i sfotografowaniu z flagą polską, powiesili na drzewie .

W końcu października Szpital niespodziewanie otrzymał nakaz ewakuacji do okolic podmiejskich, przy czym podano niezwykle krótki termin, celem uniemożliwienia wywiezienia całego cenniejszego sprzętu. Prężna organizacja i udział całego personelu w transporcie umożliwiły wysyłanie ciężko chorych do Krakowa, dzieci do Milanówka, a pozostałych chorych w liczbie 60, pracowników oraz sprzęt, bieliznę i żywność - do Radziwiłłowa Mazowieckiego. Rozładowany na przytorzu majątek Szpitala musiał być strzeżony dniem i nocą do czasu przewiezienia do Studzieńca, gdzie Szpital ulokował się w opuszczonych budynkach Zakładu Wychowawczego dla Nieletnich. Na terenie Szpitala pozostała jedynie trzyosobowa ekipa ochronna.

W opróżnionych pomieszczeniach Szpitala Zakaźnego Niemcy urządzili wielkie magazyny amunicji i materiałów wybuchowych, których częściowa eksplozja spowodowała kompletne zniszczenie czterech parterowych pawilonów, zawalenie się do połowy trzypiętrowego ,,pawilonu szkarlatyny" i poważne uszkodzenia pawilonu obserwacyjnego. Zniszczenia dopełnili Niemcy przed jego opuszczeniem, demontując wszelkie urządzenia mechaniczne kuchni, pralni, kotłowni i oddziałów, zabierając również pozostały sprzęt i bieliznę.

W okresie od 1939 roku do 1944 , oprócz wyżej wymienionych, zginęli poza szpitalem:

Ogrodnik Kazimierz Podolski, kierownik kancelarii Stanisław Sokolniki, buchalter Stanisław Filipiński, kasjer Dyonizy Kornowski, urzędniczka Hanna Dadajewska oraz zaginął bez wieści kierownik gospodarczy Zdzisław Nosarzewski.

Po upadku Powstania na Pradze, Jerzy Wilczyński, opiekun grupy bojowej przy ul. Zamienieckiej 73. Dr Witold Gadomski, dr Jan Ryfinski i inż. Kafliński, w trosce o zgrupowaną tam młodzież, wykorzystali obawę okupanta przed chorobami zakaźnymi i uzyskali zgodę komendanta Wuilburga na urządzenie szpitala zakaźnego przy ul. Siennickiej 15, w którym pracownikami i ,,chorymi" byli powstańcy i zagrożona wysiedleniem ludność Pragi. Dnia 14 sierpnia 1944 roku utworzony został na Pradze przy ul. Siennickiej 15 Szpital Zakaźny, którego Dyrektorami byli: dr Jan Ryfiński, później dr Jerzy Wilczyński, a od pierwszego października 1944 roku dr Alfons Krysztof.